PPI+机器学习+免疫浸润+实验验证，如此简单也能发4+

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of metabolic biomarkers associated with nonalcoholic fatty liver disease”，这篇文章发表在Lipids Health Dis期刊上，影响因子为4.5。

结果解读：

识别NAFLD患者的MR DEG

主成分分析（PCA）图显示了在消除数据集之间的批次效应之前和之后的GSE48452和GSE63067（图1A-D）。在合并的数据集中，总共识别出129个NASH和HC患者的DEG。其中100个基因上调，29个基因下调（图2A）。使用热图对这些DEG进行可视化（图2B）。最后，将DEG和948个MRG交集以识别18个MR DEG（图2C）。随后，进行了功能富集分析，以确定NAFLD相关MR DEG的潜在机制。图2D显示了每个分类下的前十个GO术语。结果显示，这些MR DEG主要富集在“类异戊二烯代谢过程”、“酰基甘油生物合成过程”和“脂肪酸代谢过程”中。这些MR DEGs富集的KEGG途径主要包括“类固醇激素的生物合成”以及“脂肪酸和甘油脂代谢”途径（图2E）。最后，构建了MR DEG的PPI网络，该网络包括12个节点（11个上调基因和1个下调基因）和14个边缘（图2F）。PPI网络显示LPL与PLA2G7、ME1、FADS2、ACSL4和DGAT2有相互作用。同时，FMO1与CYP1A1和UGT2A3相互作用。

代谢相关生物标志物的筛选

为了进一步挖掘关键基因，对18个MR DEG进行LASSO回归分析以筛选关键基因，并鉴定出10个特征基因，包括ACSL4、酰胺解结构域1（AMDHD1）、CA14、DGAT2、含有亚麻酸的二甲基苯胺单加氧酶1（FMO1）、IDO2、脂蛋白脂酶（LPL）、（脯氨酸4-羟化酶亚基α1）P4HA1、PKLR和TREH（图3A-B）。同时，使用RF算法鉴定了10个特征基因，包括CYP1A1、UGT2A3、P4HA1、ME1、AMDHD1、PDE11A、PLA2G7、FMO1、LPL和FADS2（图3C-D）。随后，使用这些算法获得了四个交集的基因，AMDHD1、FMO1、LPL和P4HA1（图3E），并将其定义为NAFLD中的代谢相关生物标志物（MRBs）。MRB的AUC值为?>?0.8，因此表明这些MRB具有良好的诊断准确性（图3F）。接下来，进一步验证了外部验证集（GSE89632）中生物标志物的诊断价值，结果与训练集一致（图3G）。随后，列线图（C指数?=?0.95）以进一步探索生物标志物的临床价值（图3H）。校准曲线显示，实际风险和预测风险之间的误差较小，表明列线图模型对NASH样本具有较高的预测精度（图3I）。

免疫浸润和功能富集分析

为了分析NAFLD患者的免疫微环境，在训练队列中比较了两组28种免疫细胞类型的相对丰度。结果显示，八种免疫细胞的丰度存在显著差异，包括活化的和中央记忆的CD4 T细胞、未成熟的和活化的树突状细胞（DC）、效应记忆的CD8 T细胞，肥大细胞、髓源性抑制细胞（MDSCs）和T卵泡辅助细胞（Tfh）（图4A）。图4B显示了MRB和差分ICI之间的相关性。观察到AMDHD1和Tfh细胞之间的显著负相关，以及LPL和活化的CD4 T细胞之间的正相关（图4C）。接下来，对生物标志物进行ssGSEA，以确定AMDHD1、FMO1、LPL和P4HA1在NAFLD中的可能功能。结果表明，AMDHD1主要富集在“细胞质翻译”和“ECM”中???受体相互作用’。此外，FMO1主要富集在固有的凋亡和FoxO信号通路中。“染色体分离”和“补体和凝血途径”主要由LPL富集。P4HA1主要富集在“有机酸分解代谢过程”和“神经活性配体受体之间的相互作用”中。

四个基于MRB的PPI网络

构建了一个整合AMDHD1、FMO1、LPL和P4HA1的调控网络，以确定这些MRBs的潜在调控机制。此外，将信使核糖核酸-信使核糖核酸和TF信使核糖核酸配对，构建由25个miRNA、4个信使核糖核酸、41个转录因子、37个节点和51个边缘组成的“信使核糖核酸-miRNA-TF”调控网络（图5）。结果表明，AMDHD1、P4HA1和FMO1可能具有共同的调节因子，如PAD21和CTCF。

验证MRB表达式

分别测定训练集和GSE89632中患者的预后基因表达。结果显示，与训练队列中的HC组相比，NASH组患者的FMO1和LPL表达水平增加，AMDHD1和P4HA1表达水平降低（图6A）。在GSE89632中，与HC组相比，NASH组患者的AMDHD1和P4HA1表达水平显著降低，FMO1和LPL表达水平显著增加（图6B）。最后，使用qRT-PCR测定这些MRB在患者血液样本中的表达。结果与通过分析公开数据库获得的结果一致（图7）。

总结

总结起来，包括AMDHD1、FMO1、LPL和P4HA1在内的四个MRB基因被确定并展示出良好的能力来区分NAFLD患者和健康对照组。本研究的结果将有助于确定代谢在NAFLD发生和发展中的作用，从而有助于确定诊断和治疗NAFLD患者的新靶点。