肺癌单细胞文献阅读2

文献

Single-cell transcriptomic analyses provide insights into the cellular origins and drivers of brain metastasis from lung adenocarcinoma
IF:15.9 中科院分区:1区 医学WOS 分区:Q1

背景

脑转移是最常见的恶性颅内肿瘤，约30%的实体瘤会发生，但以肺癌发生率最高。肺癌发生率高，治疗手段有限，且预后差。目前，肺癌脑转移的发生机制暂不明确，因此早期识别BM高危患者十分有必要。

摘要

文章数据：11 LUAD primary tumor (PT) ，10 BM samples (GSE131907)
采用拷贝数变异（CNV）和克隆性分析来说明BM肿瘤的细胞起源。通过伪时间轨迹分析鉴定脑转移相关上皮细胞（BMAEC）。通过使用机器学习算法，开发了BM指数，该指数代表了bulk - RNA-seq数据中BMAECs的相对丰度，揭示BM高风险。基于癌细胞系药物敏感性数据来预测BMAEC的靶向药物。

材料与方法

数据来源：单细胞病人入组选了做手术但未进行用药的病人。TCGA还能通过The Cancer Proteome Atlas获取对应的蛋白质组数据。此外，作者还用了自己的数据（北大协和医学院的）。人类癌细胞系的基因表达谱来自癌细胞系百科全书，癌细胞系的药敏数据来自（CTRP）和PRISM repurposing dataset 19Q4。

结果

1.BM、PT样本间的不同细胞组分和免疫微环境

tsne将样本分成23个簇，后续再根据差异基因注释成10类。总的来说，免疫细胞在两类样本中占大头（图1B与1C），免疫细胞中占比最多的为T细胞。BM中相对PT占比较多的为转移性ECs，其次为T细胞，巨噬细胞（图1D、1E）。二者细胞组分不一致（1F）。
将巨噬细胞重新进行聚类，分成4类（图2A与BB）。其中M1在两类样本中都很丰富，免疫抑制型M2在BM样本中更丰富（2C），M2的富集差异结果在另一数据集得到验证。使用GSVA分析得知，hypoxia, mTORC1 signaling, P53 signaling, and DNA repair被激活在BM巨噬细胞中，而interferon-gamma response, inflammatory response, and TGF-beta signaling pathway则是在PT样本中显著富集（2D）。
将T细胞进行重新聚类，分成9亚型（2E\2F），两类型样本的T组成不同，发现了PT、BM中大部分为CD4+细胞。BM样本中KRAS信号通路被激活，而PT样本中G2/M checkpoint、TGF-beta signaling、Wnt/beta-catenin signaling pathways被激活。

2.CNV和克隆分析揭示BM肿瘤的细胞来源

inferCNV用来分析PT与BM样本的上皮细胞的CNV和克隆性(3a\3b)。在PT样本中的2346个ECs中，1517个有cnv高得分，因此考虑为恶性，819个与参考聚在一块，被认为非恶性（3c）。因为脑组织中没有ec，所以脑内所有ec细胞都为恶性，且脑内的ec细胞cnv分数低的也少。利用进化系统发生树展示肿瘤克隆性和恶性肿瘤细胞的进化，结果为：在PT,所有恶性EC都存在1q扩增，42%的细胞有7p和7扩增。在BM，所有恶性EC都能观察到7p和7q扩增(图3F)。此外，位于7号染色体上的36个基因的拷贝数扩增也被PT中有7p或7q扩增的6个亚克隆细胞亚群共享(3G)。研究还发现位于PT 7号染色体上的100个基因的拷贝数扩增也存在于BM 7p或7q扩增的亚克隆中(3H)。当LUAD转移到脑时，7号染色体上35个基因的拷贝数扩增保持不变，BM样本额外产生65个基因扩增(3I)。
为进一步评估PT和BM样本的瘤内异质性，基于恶性细胞转录组学特征计算每个样本的多样性评分，结果发现PT的多样性评分显著高于BM(3J)，而PT中恶性细胞的比例显著低于BM (3 k)。GSVA发现MYC targets, PI3K/Akt/mTOR signaling, epithelial-mesenchymal transition, and cellular metabolism-related pathways路在BM的恶性细胞中显著激活(3L)。

3.伪时序轨迹识别与BM相关的特定EC亚群

将两类样本的恶性EC细胞聚类，分成11亚群，然后运用拟时序分析。结果观察到来自PT和BM的ECs基本上遵循相似的分化轨迹，并参与了7种细胞状态的转换过程(4C)。在这些细胞亚群中，只有EC2由来自PT和BM样本的细胞组成。因此，进一步对EC2进行了伪时序分析，得到了由细胞命运决定的三个细胞状态(4D)，其中状态S2主要富集于BM细胞，状态S3主要富集于PT细胞，状态S1在PT和BM中均富集(4E)。GSVA发现在三种细胞状态中分子通路的激活高度不同(4F)。随后，进行分支表达分析模型(BEAM)分析来确定这三种状态下的分支依赖性基因，总共识别了45个基因，它们可以调节从状态S1(前分支)到S2(细胞命运1)和S3(细胞命运2)的细胞分化过程(4G)。此外，由于EC2经历了从祖细胞到两种不同命运细胞的转换，因此EC2细胞被定义为BMAECs。GSVA分析发现大多数癌症相关通路在BMAECs中被激活(4H)。

4.验证BMAECs与预后转移相关

首先识别了ECs和EC2的标记基因，接着取交集作为BMAECs的标记基因。然后，将BMAECs的31个标记基因与跨细胞状态的45个分支依赖基因取交集，并将交集的6个基因定义为BMAECs最具代表性的基因(5A)，并选择S100A9作为BMAECs的标志物，结果研究使用标志物有效区分了PT和BM中的S100A9+EPCAM+恶性细胞和S100A9+炎性细胞(图5B)。接下来研究通过ROC分析观察到BMAEC比例在识别LUAD PT脑转移和NMPT方面具有良好的性能(图5E，F)。此外，生存分析显示BMAEC比例高的LUAD患者MFS显著较差(图5 G)，而OS无显著差异(图5H)。最后得出结论：BMAEC 在未来脑转移的 LUAD PT 样本中具有明显更高的丰度，并且 BMAEC 的比例越高，患者发生脑转移的时间越早。

5.TCGA-LUAD 队列中 BM 指数与临床病理特征之间的关联

采用logistic回归算法，计算499例TCGA-LUAD患者体积RNA-seq数据的BM指数，以表示BMAECs的相对丰度（图6A).从TNM I期到IV期，BM指数显著升高（P=4.1×10?07），但 T1 显著低于 T2-4 （P = .015），N0 显著低于 N1-3 （P = 4.4 × 10?07) 。单因素和随后的多因素Cox回归分析表明，BM指数是TCGA-LUAD队列中OS和DFS的独立预后预测因子（补充图6B-E）。K-M 生存分析表明，BM 指数高的患者表现出明显更差的 OS（图6B） 和 DFS（图6C).这些发现表明，BMAECs丰度较高的LUAD患者具有较高的TNM分期和较差的预后。

6.针对高BM指数患者的BMAEC治疗药物的鉴定

采用两种不同的方法来识别可以抑制LUAD脑转移的候选药物，包括靶向BMAEC的高度敏感药物和高BM指数（图6D).我们获得了 78 种用于靶向 BMAEC 的 CTRP 化合物和 65 种 PRISM 化合物，以及 23 种用于高 BM 指数患者的 CTRP 化合物和 171 种 PRISM 化合物。通过做交集，最终确定 2 种 CTRP 药物（拉帕替尼和西比林）和 5 种 PRISM 药物（LGX818、repsox、RG2833、辛伐他汀和托司他）为治疗脑转移的候选药物，其 BMAEC 和高 BM 指数患者的 AUC 值显着降低，并与 BM 指数呈负相关（图6E和补充图7）。拉帕替尼是研究其对肺癌脑转移的抑制的首选。考虑到拉帕替尼的药物靶点mRNA水平，EGFR、ERBB2和RIPK2在BMAECs中与MECs相比，与AUCs呈高表达且呈负相关（图6F).同样，ERBB3、PIK3C2B、EGFR和ERBB2在高BM指数患者中高表达，与AUCs呈负相关（图6G).考虑到药物靶点的蛋白水平，EGFR和EGFR-pY1068在高BM指数患者中高表达，与AUCs呈负相关（图6H).因此，EGFR被确定为拉帕替尼治疗LUAD脑转移的潜在靶点。需要进一步的研究来验证这些药物通过靶向 BMAEC 和高 BM 指数患者抑制 LUAD 脑转移的治疗价值。

讨论

1.尽管我们发现LUAD和BM之间的免疫微环境存在差异，但需要进一步的研究来确认免疫细胞是否对LUAD脑转移有影响
2.BM及其潜在标志物S100A9的细胞来源在我们的研究中通过scRNA-seq数据确定。然而，S100A9通常被认为是炎症细胞（如中性粒细胞或单核细胞）的标志物。尽管我们已经通过多重IF证实了EPCAM和S100A9的共定位，但明确区分S100A9阳性肿瘤细胞和炎症细胞可能具有挑战性。