1)3种常规修饰:氧化,烷基化,乙酰化。
2)一般磷酸化、泛素化前期需要做富集,自然状态下的磷酸化、乙酰化的量非常少,串联质谱根据母离子的丰度选取 topN 进行二级碎裂来检测,若前期不进行富集,最终鉴定到的磷酸化、乙酰化肽段可能不多。若客户不做富集,只在搜库时加搜修饰,则最多接受6种修饰,且涉及收费,500元/例。磷酸化富集方法有TiO2富集、PTMscan等,
目前华盈可接磷酸化蛋白组的相对定量蛋白组质谱分析。
3)多肽信息表中(peptide)包含具体哪一个氨基酸位点发生了修饰。
两种都可以。一般产物比较少,银染灵敏度较高,推荐银染。考染灵敏度低,未出现条带处也可能鉴定到蛋白。
HPLC的目的时为了保证样本按一定的时间来上质谱仪检测而设置的,实现样本梯度上质谱仪。在实际的运行中,HPLC通常为C18柱,即先注入样本,过程大约0.5h,接着按一定的梯度进行洗脱,洗脱样本则按照在流动相中的特性先后进入质谱仪进行检测。
质谱通过对肽段及离子的质荷比的检测,通过公共数据库:比如uniprot,NCBI等,得到实验样本对应的蛋白数据库,然后设置理论酶切,得到的理论肽段与实验的原始谱图采用搜酷软件比如PD,maxquant等进行比对,设置一定的参数阈值,最后实现蛋白的准确定性。
蛋白质谱是基于物理学的原理通过质荷比、保留时间等确定分子量,然后借助数据库的比对实现肽段和蛋白的鉴定和定量;蛋白芯片是基于抗原抗体的特异性免疫反应,对一系列特定的指标进行检测,一般通过信号值来判断具体指标的信号;
技术的选择上,一般如果只关注一些比较特定的常见指标,优先考虑蛋白芯片,或者关注的指标属于低峰度蛋白不一定能够检出,蛋白质谱适用于研究全谱蛋白或者是想研究一些不确定蛋白的项目。
原则上只要能提取到蛋白,就可以做蛋白组检测。样本测到的蛋白种类跟数据库和样本本身蛋白浓度有关,一般数据库越大,可以鉴定到的蛋白质数量越多。也与样本的类型有关,通常,组织细胞相比于体液样本,能够鉴定到更多的蛋白。
血清、血浆、脑脊液等体液样本,高丰度蛋白比例达到97%~99%,包括白蛋白、免疫球蛋白、IgG、IgA、抗胰蛋白酶、纤维蛋白原、转铁蛋白等。高丰度蛋白的存在会影响低丰度蛋白的检测,而低丰度蛋白往往是比较关注的生物标记物或者药物靶点,常规是建议去除高丰度蛋白再检测。
可以的。第一种是胶条鉴定时定性分析用PSM做粗略的定量。
第二种胶条鉴定实验时我们是没法做蛋白定量的,所以需要客户做Co-IP或Pull down实验时要进行等蛋白量量上样,在切胶时也要保证切的就是鉴定的目的条带,我们在搜库的时候可以使用定量的方法来进行搜库。