纳米抗体文库筛选（固相筛选）-泰克生物

随着噬菌体抗体库的应用范围不断扩大，可用于筛选抗体的抗原形式也是多样发展的，可以是病理切片、完整的细胞，甚至是活体动物的器官。经文库筛选所得抗体的特异性和亲和力可以进行优化和调节。使用该技术不仅可以有效避开免疫过程中获得的特异性人源抗体，还能克服单克隆抗体制备效率低、杂交瘤体外培养稳定性差、方法耗时耗力等缺点。

一．固相筛选的原理

固相筛选是将抗原包被于固相有机介质（例如酶标板、有机膜或免疫管）上，通过将抗原与抗体库共同孵育，特异性噬菌体抗体可以与抗原结合。该方法简单，技术成熟，比较容易获得高亲和力的抗体，筛选的效率与靶抗原的纯度相关。而液相筛选方法主要是将生物素化的抗原涂覆在与抗生物素偶联的磁珠上，然后使用噬菌体文库进行多轮筛选。

二．固相筛选步骤：

（1）用50mmol/L碳酸氢钠缓冲液（pH 10.0）稀释抗原，用酶联免疫吸附试验（ELISA）板包被，每孔100μL，于4℃放置过夜

（2）次日用PBS/5%牛奶密封1小时，将其投入至噬菌体文库，37℃孵育2小时，用PBS/0.05%吐温（PBST）洗涤6次，并向每个孔中加入200μL洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体，然后用2mol/L Tris-HCl中和。

（3）测量噬菌体滴度并扩增，用于下一轮筛选。遵循“吸附-洗脱-扩增”方法，共进行了3轮洗脱，随后的2轮筛选逐渐减少了抗原包被的量，使特异性噬菌体高度富集。

图1 固相筛选流程

三．固相载体的种类和选择

常用载体种类	塑料制品	微粒	膜载体
结合方式	最常用的塑料制品是聚苯乙烯，抗原或抗体以非共价或物理吸附的方式结合在该载体上。	容易与抗原或抗体形成化学偶联，结合容量大。能均匀地分散在整个反应溶液中，所以反应速度较快。	常用的膜载体有硝酸纤维素膜（Nc），尼龙膜及玻璃纤维素膜，通过非共价键的形式吸附抗体/抗原。
简介	会有结合容量不大，洗脱吸附效率较高且不均一的缺点，目前常用非共价和化学偶联共价吸附的方法改善。	可制成磁化微颗粒	广泛应用于定性或半定量斑点ELISA

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四．固相筛选的优势

（1）不经过体内免疫即可获得抗体，筛选的标靶可以是任何抗原，易于亲和力成熟及结构改造。

（2）噬菌体抗体库是基因型和表型的统一，同时又能将抗体选择能力和噬菌体的扩增能力进行组合，是一种极其有效的筛选系统。

五．固相筛选的常用策略

表位筛选：表位（Epitope）是抗原表面的一段决定位点，该位点的主要功能是决定抗原与抗体的结合特点和折叠状态。它既可以是抗原一级结构中一段连续的氨基酸残基，即线性表位，也可以是不连续的，但却包含有结合受体所必需的某些氨基酸，即构象表位。由于空间表位难以模拟，对于一些不容易纯化得到的受体，可针对受体胞外区的一段已知线性表位进行纯化，这样要比纯化全长膜受体要容易得多，或者直接化学合成的线性中和多肽。

六．固相筛选优化策略

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抗原浓度方面	洗涤条件方面
筛选用的抗原存在一个有效的浓度。抗原浓度过高时，非特异吸附大大增加，使得筛选轮数增多，工作量加大；同时有可能导致高亲和力的抗体结合上去不能被解离下来，造成克隆丢失。抗原浓度过低时，可能会导致亲和力不高的功能抗体结合不上去，无法被富集筛选。	洗涤严谨度过高,会导致那些有功能但亲和力较低的噬菌体抗体被洗掉;严谨度过低,又会导致非特异结合的增加。

七．细胞筛选的实验流程

泰克生物具有完善的上下游对接服务，包括抗原、抗体的表达纯化、抗体人源化、重组抗体表达等服务。在文库构建方面具有成熟稳定的技术，噬菌体展示技术提供1级免疫文库的建库库容为108-109，插入率均满足>95%，筛选获得的抗体亲和力普遍处于nM-pM级别。具备多种筛选体系，包括直接筛选法、竞争法、负筛选法、细胞筛选法等，可提供VHH筛选、scFv序列筛选、Fab抗体筛选等，满足不同客户的不同需求。产品交付标准高：针对免疫库，交付免疫前后血清，抗体展示文库，筛选洗脱产物，CDR区域补充度的纳米抗体序列，QC质控标准（含RNA提取，cDNA制备等）。

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