? ? ? ?真核蛋白表达技术在生物制备和研究领域中具有广泛应用。真核蛋白表达是通过转染外源基因至真核细胞，使其合成目标蛋白。相比于原核表达系统，真核系统可以实现对蛋白的正确折叠和翻译后修饰，适用于需要高度功能性蛋白的生产。
1、真核蛋白表达原理
? ? ? 真核蛋白表达是通过将外源基因导入真核细胞，利用宿主细胞的生物合成机制合成目标蛋白的过程。以下是真核蛋白表达的基本原理：
①、基因克隆和构建表达载体：
? ? ? ?首先，目标基因需要被克隆至表达载体中。表达载体是一种DNA分子，通常包含了启动子（promoter）、选择标记（selectionmarker）、终止子（terminator）等基本元件，以及可能的调控元件，如增强子（enhancer）和调控序列（regulatorysequences）。
②、转染至真核细胞：
? ? ? ?构建好的表达载体通常通过转染或转染类似的技术被引入真核细胞中。这可以通过多种方法实现，如电穿孔、化学转染、基因枪等。一旦载体成功进入细胞，其中的目标基因将被宿主细胞的核内机制识别并启动表达。
③、转录和翻译：
? ? ? ?在真核细胞中，转录是指在核内将DNA模板转换为RNA的过程。启动子和调控元件的作用使目标基因的转录得以启动，生成一份相应的mRNA。随后，mRNA通过核孔移动到细胞质，接受翻译过程，将其翻译成蛋白质。
④、后翻译修饰：
? ? ? ?真核蛋白表达系统中，翻译后的蛋白通常经历多种后翻译修饰，包括但不限于：
? ? ? 糖基化：在内质网和高尔基体中，蛋白质可能会接受糖基的添加，形成糖基化修饰。
? ? ? 磷酸化：蛋白质中的特定氨基酸残基可能会被磷酸化，这是一种常见的蛋白质修饰形式。
? ? ? 乙酰化、甲基化等：蛋白质可能在特定的氨基酸上经历其他修饰，如乙酰化、甲基化等。
⑤、蛋白质折叠和组装：
? ? ? 翻译后的多肽链会在细胞中经历正确的折叠和组装，形成功能性的蛋白质。这一过程通常涉及分子伴侣（chaperone）的协助。
⑥、目标蛋白的定位和功能发挥：
? ? ? 最终的蛋白质会定位到细胞的特定位置，可能是细胞质、内质网、高尔基体、细胞膜，甚至细胞外。蛋白质的功能会在其最终的位置发挥，从而影响细胞的生理活动。
? ? ? 真核蛋白表达系统的优势在于能够实现蛋白质在天然环境中的正确折叠和修饰，因此特别适用于需要复杂后翻译修饰或对蛋白质结构和功能高度依赖的研究和生产需求。
2、真核蛋白表达流程
①、基因克隆和构建表达载体：将目标基因克隆至真核表达载体，该载体通常包括启动子、选择标记和调控元件。
②、细胞培养：转染表达载体至真核细胞，培养细胞使其表达目标蛋白。
③、收获和裂解：收获表达的真核细胞，通过细胞裂解获得蛋白。
④、纯化：利用各种纯化方法，如层析、透析、离心、沉淀等，逐步提高蛋白的纯度。
3、真核蛋白表达常用方法
? ? ? ?真核蛋白表达的方法多种多样，选择合适的方法通常取决于实验的具体需求、目标蛋白的性质以及研究者的经验。以下是一些常用的真核蛋白表达方法：
①、哺乳动物细胞表达系统：
细胞类型：CHO细胞（Chinese Hamster Ovary）、HEK293细胞（Human Embryonic Kidney 293）等。
特点：适用于大规模生产复杂蛋白，具有较好的糖基化和其他后翻译修饰能力。
②、昆虫细胞表达系统：
细胞类型： Sf9细胞、Sf21细胞（Spodoptera frugiperda）等。
特点：适用于一些较简单的真核蛋白表达，成本相对较低，易于操作。
③、酵母表达系统：
细胞类型：酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、毕赤酵母（Pichia pastoris）等。
特点：酿酒酵母表达系统适用于表达小到中等规模的蛋白，毕赤酵母则适用于较大规模和高密度的表达。
④、植物表达系统：
细胞类型：植物细胞、植物真核细胞（如Nicotiana benthamiana）。
特点：适用于一些特定需求，例如植物天然的糖基化和其他翻译后修饰。
⑤、真核病毒载体介导表达：
病毒类型：腺病毒（Adenovirus）、适当的冠状病毒等。
特点：通过感染宿主细胞，病毒载体能够高效地传递目标基因，实现高水平的蛋白表达。
⑥、转基因动物表达系统：
动物类型：小鼠、大鼠、绵羊等。
特点：通过将目标基因导入动物胚胎细胞，使得表达在整个生物体内进行，适用于研究整个生物体内的蛋白表达和功能。
⑦、质粒DNA转染法：
原理：将表达载体通过质粒DNA转染至真核细胞。
特点：适用于多种真核细胞类型，操作简便，但表达水平相对较低。
⑧、电穿孔法和基因枪法：
原理：通过电场或高压气体驱动，将表达载体导入真核细胞。
特点：适用于一些难以转染的细胞，例如神经元。
⑨、条件性表达系统：
原理：利用特定的诱导剂或条件，在需要的时候启动目标蛋白的表达。
特点：可以在特定的时间点或条件下控制蛋白的表达，有利于研究蛋白在生物体内的功能。
? ? ? ?在选择真核蛋白表达方法时，需要根据实验的具体要求、所需蛋白的性质以及实验室设备和经验等因素进行综合考虑。不同的系统具有各自的优缺点，研究者可以根据研究的具体目标来选择最适合的表达系统。
4、真核蛋白表达注意事项
在进行真核蛋白表达实验时，研究人员需注意以下事项：
①、选择适当的表达系统：根据蛋白的性质和需求选择合适的真核表达系统。
②、优化表达条件：对表达条件进行优化，包括培养条件、转染条件等，以提高表达效率。
③、谨慎选择纯化方法：根据蛋白的性质选择合适的纯化方法，避免对蛋白的结构和活性造成不可逆的影响。
? ? ? ? 真核蛋白表达技术的不断发展为科研人员提供了更多选择，可在不同的实验和应用场景中获得高效表达的真核蛋白。通过深入理解其原理和流程，研究人员能够更好地利用这一技术手段进行生物大分子的研究和生产。