通过多组学调查揭示人类原发性和转移性脑肿瘤中T细胞表型多样性

导语

今天给同学们分享一篇实验文章“Phenotypic diversity of T cells in human primary and metastatic brain tumors revealed by multiomic interrogation”，这篇文章发表在Nat Cancer期刊上，影响因子为22.7。

结果解读：

单细胞RNA测序在携带脑转移瘤的个体中鉴定出pTRT细胞

为了评估脑癌（特别是胶质瘤和脑转移瘤）患者中T细胞的表型和功能异质性程度，作者使用了一个综合分析流程 27 ，在单细胞和群体水平上对RNA和蛋白质表达进行了分析（扩展数据图1a）。作者首先通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析了6例脑转移瘤患者和3例胶质瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）和匹配的循环T细胞（补充表1a和扩展数据图1b）。总共分析了55,000个T细胞的统一流形逼近和投影（UMAP）显示TILs和循环T细胞之间存在显著的转录差异（图1a），以及CD4 + 和CD8 + T细胞之间的差异（图1b）。作者鉴定出17个不同的聚类（图1c）：七个CD8 + T细胞聚类（C1、C2、C3、C6、C7、C14和C16）和八个CD4 + T细胞聚类（C0、C4、C5、C8、C9、C10、C11和C13），其中C4代表调节性T（T reg ）细胞（图1c和补充表1b）。C12和C15包含了CD4 + 和CD8 + T细胞。冷冻保存并未改变T细胞亚群的组成和表型（扩展数据图1c-e），与先前的研究一致 28 。

BrM的个体子集显示相对较高的pTRT细胞丰度

为了扩大作者的分析范围，超过了scRNA-seq分析中的9个个体，作者接下来对更大的队列进行了分析，包括来自54名脑癌患者和12名健康供体（HDs）的TILs和匹配的血液T细胞，使用人群总体RNA-seq（称为“总体RNA-seq队列”；附表1a和扩展数据图2a）。主成分分析显示TILs和循环T细胞之间的最大差异，而来自脑癌患者或HDs的血液中的T细胞聚集在一起（图2a，顶部，和附表2a）。CD4和CD8 T细胞群体在血液和肿瘤样本中分离（图2a，底部）。使用免疫学特征基因集的分子签名数据库（MSigDB）C7集合，血液T细胞和TILs之间的基因集富集分析（GSEA）显示TILs中CD4和CD8激活和分化基因集富集程度最高，而血液样本中的基因集富集了原始T细胞（图2b，扩展数据图2b和附表2b）。为了确认这些发现，作者使用流式细胞术（扩展数据图2c）评估了不同CD45亚型的表达。与HD和匹配的血液T细胞相比，TILs中CD45RO的比例为90%以上（图2c）。综上所述，这些数据表明脑TILs中存在一种保守的广泛激活和分化程序，似乎与潜在疾病无关。

丰富且克隆扩增的CD8 T细胞在pTRT细胞高表达的脑转移瘤中

为了验证转录组基于的发现，作者使用了一种独立的方法和独立的队列，接下来通过流式细胞术（FCM）分析了25个脑肿瘤样本（其中3/25个样本也进行了RNA-seq分析）。作者使用CD39作为潜在肿瘤反应性CD8 T细胞的标记物，这在不同类型的癌症中已经被提出，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、头颈部鳞状细胞癌、结直肠癌和黑色素瘤（图3a）。细胞进一步被筛选为CCR7，以消除潜在的旁观者幼稚和记忆细胞的污染（图3b）。在BrM和胶质瘤患者的血液中，CD8 CD39 CCR7细胞几乎无法检测到，而在TILs中，作者发现BrM中的比例明显高于胶质瘤（图3b）。与转录组分析类似，这种差异是由BrM中的一部分个体（6/13）驱动的，这些个体中CD39 CCR7 TILs的丰度较高（占所有CD8 T细胞的30%以上）。作者观察到显著的相关性（R = 0.9285，P < 0.002）在FCM检测到的CD39 + CCR7 low TILs的比例与scRNA-seq数据中C3的丰度之间存在相关性（扩展数据图图3a）。在显示CD39 + CCR7 low TILs高积累的个体样本中，作者比较了CD39 + CCR7 low 细胞与CD39 – CCR7 low 细胞上与新抗原反应性T细胞相关的四种分子的表达（图图3c）。CD39 + CCR7 low 细胞相对于其CD39 –&nbsp;对应物表达了CD103（由ITGAE编码）、CXCL13、PD1（由PDCD1编码）和TIM3（由HAVCR2编码），表明CD39 + CCR7 low 群体确实包含pTRT细胞（图图3d）。

pTRT细胞存在于BrM血管周围的生态位（PVNs）、基质和肿瘤巢中

作者接下来查询了T细胞，尤其是pTRT细胞在脑肿瘤中的空间组织。作者对20名患有脑癌的个体的组织切片进行了多重免疫荧光染色（扩展数据图4a）。由于CXCL13（分泌蛋白）和CD39（在血管上的表达水平高于T细胞），不适合用于免疫荧光染色，作者使用CD45 + CD3 + CD8 + T细胞上CD103和PD1的共表达作为潜在肿瘤特异性的指标（扩展数据图4b）。根据scRNA-seq确定的C3的频率、通过批量RNA-seq分析的CD8 + T细胞中C3特异基因的富集程度，或者通过FCM检测到的CD39 + CCR7 low CD8 + T细胞的丰度，将脑转移瘤（BrM）的个体分为pTRT细胞高或pTRT细胞低两组（扩展数据图4c）。通过不同方法进行的分组在使用多种技术分析的样本中是相同的（扩展数据图4d）。CD103 + PD1 + CD8 +&nbsp;肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）在pTRT细胞高的脑转移瘤中比pTRT细胞低的脑转移瘤或胶质瘤中更丰富（图4a，b）。此外，作者通过IF观察到pTRT细胞高表达的BrM中CD8 TIL总浸润较高（扩展数据图4e），这与图3e中的FCM分析结果相一致。

与高pTRT细胞丰度相关的一种独特的髓系细胞亚型

作者接下来调查了高pTRT细胞丰度是否与不同的肿瘤微环境有关，特别是与髓系细胞有关，已经有研究表明髓系细胞在肾脏、前列腺、膀胱和卵巢癌中调节肿瘤特异性T细胞的功能。对25个样本中的>4 × 10个细胞进行空间成像分析发现，在pTRT细胞高的脑转移瘤中，较大比例的CD8 TILs与肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）靠近（20μm），其中包括驻留的小胶质细胞（MG；鉴定为CD45 CD68和/或P2RY12 CD49D）和招募的单核细胞源性巨噬细胞（MDMs；鉴定为CD45 CD68和/或P2RY12 CD49D），相比于胶质瘤或pTRT细胞低的脑转移瘤，这可能导致潜在的直接细胞间相互作用。这一观察结果可能部分受到pTRT细胞高的脑转移瘤中总CD8 TILs比例较高的影响。因此，作者接下来分析了CD8 TILs与其最近的TAMs之间的距离。作者发现CD103 + PD1 + CD8 + TILs与最近的MG之间的距离显著较近，尽管程度适度，与最近的MDM之间的距离与其他所有CD8 + TILs相同（图（图5b5b和扩展数据图图5）。这些结果表明，pTRT细胞和非pTRT细胞与TAMs进行沟通的可能性相似。

作者接下来检查了在pTRT细胞高和细胞低的肿瘤中，TAM与T细胞之间的通讯潜力是否存在差异。作者分析了来自同一肿瘤样本的分选的MG和MDM的转录组，同时作者也收集了T细胞（扩展数据图6a、b）。使用Hallmark和Gene Ontology生物过程基因集进行GSEA分析，发现MG和MDM之间存在显著差异（图5c和附表3a）。特别是，与干扰素反应和抗原呈递相关的基因集在从pTRT细胞高的BrM中分离的TAM群体中富集程度较高，相比于pTRT细胞低的BrM和胶质瘤样本（图5c）。此外，TAM中抗原呈递基因的富集程度与CD8 T细胞中pTRT细胞特征基因的富集程度之间存在强相关（图5d）。差异表达分析确认了干扰素反应和抗原呈递基因的上调，并且还揭示了pTRT细胞高的BrM中TAM中T细胞招募分子CXCL9、CXCL10和CXCL11的表达显著增加（图5e，扩展数据图）。6b6b和补充表3b）。此外，TAM中T细胞招募趋化因子的表达水平与同一样本中CD8 + T细胞的丰度显著相关（图5f）。值得注意的是，除了招募和激活T细胞的能力外，来自pTRT细胞高表达的BrM的TAM还表达了高水平的IDO1，这表明它们可能具有抑制T细胞的特性（扩展数据图6c）。

与颅内癌相比，对比pTRT细胞在颅内转移癌和颅外癌中的表现

目前对于脑癌中的pTRT细胞了解甚少，但这些细胞已在几种颅外肿瘤类型中进行了研究。因此，作者接下来比较了颅内和颅外肿瘤中的pTRT细胞。作者首先分析了来自21种不同颅外癌症类型和316名个体的单细胞RNA测序数据，以了解BrM pTRT细胞单细胞RNA测序聚类C3中前十个基因的表达情况。有趣的是，作者发现所有十个基因在CD8.c12.Tex.CXCL13聚类中的表达最高，该聚类已被注释为含有最大比例的pTRT细胞，从而表明颅内和颅外pTRT细胞之间存在相似性（图6a）。

为了进一步扩展这些发现，作者对额外的TILs和从12名胶质瘤患者（8例IDH野生型和4例IDH突变型）、13名脑转移瘤患者（10例非小细胞肺癌，1例黑色素瘤，1例表皮癌和1例肉瘤）、11名原发性乳腺癌患者和33名非小细胞肺癌患者的血液T细胞中进行了高维FCM分析（图6b和附表1a和4）。与前述相同，作者关注CD8 T细胞。在对这些数据进行归一化后，作者进行了无监督聚类，并定义了12个不同的细胞学亚型（CCs），其中几个显示出明显的组织特异性优势（图6c和扩展数据图7a、b）。通过分析单个蛋白质，作者发现了一个pTRT细胞亚型CC9，其表达CD39、CXCL13、TIM3、PD1和CD45RO的水平较高（图6d）。如预期，所有疾病组的血液样本中都缺乏CC9细胞，而在肿瘤中，这些细胞以不同的频率被检测到（图6d、e和扩展数据图7a）。在胶质瘤和原发性乳腺癌肿瘤中，CC9细胞平均占所有CD8 TILs的5%，只有1个乳腺癌肿瘤样本（1/11）显示高CC9含量（图 6e，f）。相比之下，绝大多数原发性非小细胞肺癌（NSCLC）肿瘤显示出高浸润的CC9细胞，平均占肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的25%。在脑转移瘤（BrM）中，作者再次区分出两组个体，一组CC9细胞含量低（7/13），另一组CC9细胞含量高（6/13）（图6f）。在CC9细胞含量高的六个脑转移瘤肿瘤中，包括一个黑色素瘤-脑转移瘤和十个非小细胞肺癌-脑转移瘤。值得注意的是，在CC9细胞比例高（>30%）的原发性非小细胞肺癌和脑转移瘤肿瘤中，这些细胞的含量相似（图6e，f）。总体而言，CC9细胞在疾病组之间的变异性较大（扩展数据图7c）。

总结

总之，这项研究对于脑癌患者的临床管理具有重要意义。CXCL13表达（CD39 +&nbsp;）的CD8 + T细胞的丰度以及肿瘤微环境中CXCL9的表达是许多不同原发癌症类型（包括肺癌和三阴性乳腺癌）对免疫检查点抑制剂（ICB）反应的强有力预测因子。这些因素也可能表明脑部对ICB的敏感性，作者发现这两个因素在pTRT细胞高表达的脑转移瘤中显著富集。此外，pTRT细胞高表达的脑转移瘤中CXCL13 + CD39 + CD8 + TILs的比例与原发非小细胞肺癌（ICB反应最好的癌症之一）相似。这表明只有pTRT细胞高表达的肿瘤患者才有可能从这种治疗中获益，而pTRT细胞低表达的肿瘤患者则不会。虽然如何在不进行手术切除的情况下评估脑肿瘤的pTRT细胞状态仍然是一个悬而未决的问题，但作者的数据提供了加强研究脑肿瘤中T细胞数量和质量的最小侵入性程序的理由。