7+衰老+WGCNA+机器学习+实验，非肿瘤领域的衰老相关研究

今天给同学们分享一篇生信文章“Identification of aging-related biomarkers and immune infiltration characteristics in osteoarthritis based on bioinformatics analysis and machine learning”，这篇文章发表在Front Immunol期刊上，影响因子为7.3。

结果解读：

数据处理

作者整合了三个滑膜数据集，包括GSE55235、GSE55457和GSE12021，共计29个正常滑膜样本和30个OA滑膜样本。作者对每个样本在消除批次效应前后的基因表达水平和主成分分析（PCA）进行了分析。

ARDEGs的鉴定和PPI分析

作者使用R包limma和筛选标准|logFC|>0.5和FDR<0.05，鉴定出了87个与衰老相关的差异表达基因（ARDEGs），其中32个基因在OA中上调，55个基因在OA中下调。附录材料的表S2中包含了差异表达的衰老相关基因的详细列表。热图和火山图被用来描述差异（图2A、B）。PPI蛋白质网络相互作用分析显示ARDEGs在蛋白质水平上密切相互作用（图2C）。

ARDEGs的功能富集分析

为了更好地理解OA中ARDEGs的潜在机制，作者使用R包clusterProfiler对ARDEGs进行了GO、KEGG和DO富集分析。GO富集分析显示，前五个ARDEG富集主要涉及对细胞外刺激的响应、神经元死亡、腺体发育、对营养水平的响应以及神经元死亡的调节。细胞组分（CC）和分子功能（MF）中的前5个富集项如图3A所示。此外，KEGG通路分析显示这些ARDEGs富集在HIF-1信号通路、FoxO信号通路、Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染、PI3K-Akt信号通路和MAPK信号通路中，并且这些通路之间存在密切的相互作用（图3B、C）。DO富集分析显示了与OA中ARDEGs具有相似致病机制的疾病类型，如前列腺癌、男性生殖器官癌、乙型肝炎、女性生殖器官癌和丙型肝炎（图3D）。表S4-S6显示了ARDEGs的GO、KEGG和DO富集的详细结果。

GSVA富集分析

作者通过GSVA方法对OA中的HALLMARKS和KEGG通路富集进行了调查。根据HALLMARKS通路富集结果，与对照组相比，TNFA信号通过NFKB通路、细胞凋亡和P53通路在OA中显著上调。与此同时，DNA修复、氧化磷酸化和胆汁酸代谢都显著降低（图4A）。根据KEGG通路富集结果显示，前三个通路在OA中显著上调，分别是小细胞肺癌、脂肪细胞因子信号通路和慢性髓性白血病。相反，利什曼病感染、戊糖磷酸途径和脂肪酸代谢都显著下调（图4B）。

WGCNA

作者使用了R包WGCNA，将基因表达方差的前50%作为筛选条件，排除了不太稳定的基因，并使用6538个基因构建了共表达网络。选择了值为18的最佳软阈值（R 2 =&nbsp;0.9），建立了一个无标度网络（图5A）。随后，使用聚类分析来识别高度相似的模块，最小模块大小设置为60。通过动态混合剪切，得到了八个基因模块，其中一个红色模块（217个基因）与OA具有最高的相关性（cor = 0.86; P = 3e-18）（图5C）。此外，红色模块内GS和MM之间存在很强的相关性（cor = 0.72; P=5.8e-36）（图5D）。选择红色模块中cor.MM>0.7和cor.GS>0.5的基因作为关键基因，并与ARDEGs相交，得到了20个具有OA-ARDEGs的基因（图5E）。数据集的共表达模块结果可以在补充材料中找到：表格S7。

OA-ARDEGs的相关性和富集分析

作者通过皮尔逊相关系数评估了OA-ARDEGs之间的相关性。发现MCL1与ZFP36（cor=0.87）和BHLHE40（cor=0.74）高度相关（图6A）。图6B显示了OA-ARDEGs的染色体位置。KEGG通路富集分析显示，OA-ARDEGs富集的前五个通路主要涉及Kaposi肉瘤相关疱疹病毒感染、IL-17信号通路、人T细胞白血病病毒1感染、AGER-AGE信号通路在糖尿病并发症中的作用以及TNF信号通路（图6C）。GO富集分析显示，OA-ARDEGs在生物过程中富集了对应于应激下的转录调控、应激下的DNA模板转录调控、髓系细胞（图6D）。

Hub OA-ARDEGs的识别和验证

为了提高Hub OA-ARDEGs诊断OA的准确性，作者使用了三种机器学习算法，LASSO（图7A，B），SVM-RFE（图7C，D）和随机森林（图7E，F），来筛选OA-ARDEGs。在结合三种算法的结果后，共获得了五个Hub OA-ARDEGs，分别是MCL1，SIK1，JUND，NFKBIA和JUN（图7G）。

构建Hub OA-ARDEGs风险预测模型

作者根据Hub OA-ARDEGs的表达开发了一个OA诊断图谱，以获得更具临床应用价值的OA诊断模型。通过构建临床校准曲线（图8B）、临床决策曲线（图8C）和临床影响曲线（图8D）来评估该模型，可以明确该模型对OA具有很高的预测能力。图谱中每个基因的得分准确预测了OA疾病的风险（图8A）。

Hub OA-ARDEGs表达和诊断价值

根据训练集和验证集中Hub OA-ARDEGs的表达水平，作者发现在所有OA滑膜样本中，Hub OA-ARDEGs明显下调（图9A-C）。ROC曲线分析显示，训练集中的5个Hub OA-ARDEGs和诊断图具有较高的OA诊断价值。MCL1和诊断图具有最高的诊断价值（AUC=1.000），其他基因的诊断价值如下：JUN（AUC=0.960），SIK1（AUC=0.955），NFKBIA（AUC=0.976）和JUND（AUC=0.968）（图9D）。图9E、F显示了外部验证集GSE1919和GSE89408的ROC分析结果。验证集中所有五个Hub OA-ARDEGs和诊断图的AUC均大于0.5。因此，这五个Hub OA-ARDEGs可以作为可靠的OA诊断生物标志物，并具有较高的诊断价值。

qRT-PCR

作者对六名半月板损伤患者和六名OA患者的滑膜总mRNA进行了qRT-PCR，以进一步验证Hub OA-ARDEGs的mRNA表达水平。结果显示，所有五个Hub OA-ARDEGs在OA滑膜样本中均显著下调（p值小于0.05），与训练集中的表达一致（图10A-E）。

构建miRNA-TF-mRNA调控网络

通过预测Hub OA-ARDEGs上的miRNA和TF，作者使用Cytoscape（3.7.1）来可视化调控网络，其中包含80个miRNA，12个转录因子和5个基因，并获得了总共196个miRNA-TF-mRNA调控关系（图11）。

免疫浸润分析

作者使用ssGSEA算法发现，在OA样本中，激活的B细胞、未成熟树突状细胞、巨噬细胞、调节性T细胞、中央记忆CD4 T细胞、记忆B细胞和效应记忆CD4 T细胞的浸润水平显著增加。相反，嗜酸性粒细胞、第2型辅助T细胞和中央记忆CD8 T细胞在OA样本中的浸润显著减少（图12A、C）。作者应用Spearman相关分析免疫细胞之间的相互作用。结果显示大多数免疫细胞之间存在显著相关性，例如巨噬细胞和MDSC之间存在显著正相关（r = 0.89）（图12B）。OA样本中的检查点、HLA、副炎症、T细胞共抑制、T细胞共刺激、Type I IFN反应和其他免疫功能显著激活（图12D）。OA样本中HLA基因表达水平较高，包括HLA-DMA和HLA-DRA（图12E），这表明免疫反应在OA的发展中起着重要作用。JUND、JUN、MCL1、NFKNIA和SIK1与多种免疫细胞和免疫功能相关良好（图12F、G）。例如，JUN与激活的CD4 T细胞、2型T辅助细胞和aDCs呈正相关，与巨噬细胞、肥大细胞、记忆B细胞和检查点呈负相关。JUND与γδ T细胞和APC共抑制呈负相关。MCL1与自然杀伤T细胞、激活的CD4 T细胞呈正相关，与CD56明亮的自然杀伤细胞和APC共抑制呈负相关。NFKBIA与激活的B细胞、激活的CD8 T细胞等呈负相关。SIK1与中央记忆CD4 T细胞、中央记忆CD8 T细胞和细胞溶解活性呈正相关，与中性粒细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、APC共抑制、II型干扰素反应和HLA呈负相关。

总结

总之，本研究初步探讨了OA滑膜组织中与衰老相关基因的潜在机制，揭示了滑膜衰老可能与免疫炎症密切相关。此外，五个中心节点OA-ARDEGs在OA的诊断能力方面表现出色，可能成为OA诊断和治疗的新靶点。然而，需要进一步的实验研究来支持作者的发现。