干货！如何验证转录因子与靶基因启动子互作？

今天我们就来介绍一下常用的验证转录因子与靶基因启动子互作实验手段。

01

ChIP-qPCR（首选，体内实验）

ChIP-qPCR是一种用于研究蛋白质与DNA相互作用的技术。它结合了ChIP（染色质免疫沉淀）实验和qPCR（定量聚合酶链反应）分析，可以精确定量特定蛋白质与特定基因座的结合。ChIP技术利用抗体特异性富集与特定转录因子/组蛋白修饰结合的DNA片段；qPCR技术使用SYBR荧光染料，非特异性的掺入DNA双链，发射荧光，保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步，最后利用Ct值（循环阈值）进行定量分析，可以计算出结合蛋白的富集程度。ChIP-qPCR能够专一，灵敏，快速，高重复地定量生物样品中特定转录因子/组蛋白修饰与已知基因启动子的结合。ChIP-qPCR因其体内富集（相比体外实验）能够更真实地反映结合状态的特性，被众多老师青睐，也是文章首选验证方式。? ?

• 实验流程：

02

双荧光素酶报告实验（LUC）（体内实验）

Dual-Luciferase双萤光素酶报告基因检测系统在细胞中同时表达萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶，两者没有种源同源性并对应不同的反应底物，故而没有交叉干扰。以Luciferase为核心，构建研究对象到相应位置，转染细胞（植物通常为烟草叶片或原生质体），裂解细胞，分别加荧光素酶底物，用荧光测定仪检测荧光强度，通过数据得出基因表达量，从而确定构建序列的功能（正调控或负调控）。双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。该技术通常需要与其他技术配合验证。

• 实验流程：

03

酵母单杂交（Y1H）点对点验证（体外实验）

酵母单杂交技术是由酵母双杂交GAL4系统衍生发展而来，是一种在酵母细胞内分析与鉴定转录因子与DNA顺式作用元件相互结合的有效方法。简单来说，将已知特定顺式元件构建到最基本启动子（minimal promoter, Pmin）的上游，报告基因连接在启动子下游，构成包含target DNA Element(bait sequence)的诱饵DNA。将转录因子构建到可以表达AD激活结构域的载体上，表达形成融合猎物蛋白（prey）。如果顺式作用元件和转录因子结合，会激活Pmin启动子，从而促使报告基因表达。因此，可以通过检测报告基因表达与否来判断顺式作用元件与转录因子是否发生互作。

• 实验流程：

04

凝胶阻滞实验EMSA（体外实验）

凝胶阻滞实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前也可用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用，是转录因子研究的经典方法。

通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和生物素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。生物素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异）， 和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。

• 实验流程：

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以上4种技术是目前文章中比较常用的转录因子与靶基因启动子互作验证的技术手段（爱基百客均可提供服务），一般来说文章会选择2种及以上技术手段进行验证，同时考虑兼顾体内验证和体外验证，在实际应用中，可以根据实验目的和样品特点选择合适的方法。

客户研究案例一：

• 发表日期：2022年9月

• 发表期刊：Postharvest Biology and Technology

• 影响因子：7.0

• 实验方法：ATAC-seq、RNA-seq、EMSA、ChIP-qPCR、Y1H等

• 研究背景：

番木瓜(Carica papaya)是典型的呼吸跃变型水果，在成熟过程中多种生理变化迅速发生。乙烯在此过程中促进水果成熟发黄软化，乙烯受体抑制剂1-methylcyclopropene(1-MCP)可显著延长香蕉、苹果、木瓜等水果的成熟时间应用适当剂量的1-MCP会延缓木瓜果实的着色和软化，而不当使用1-MCP处理会导致木瓜的异常成熟为“橡胶质地”。因此，这一现象严重限制了1-MCP在采后木瓜产业中的应用。前人研究结果表明乙烯和生长素可相互作用调节果实成熟，但在番木瓜果实成熟过程中生长素和乙烯的相互作用以及调控分子机制尚不清楚。

• 研究路线：

客户研究案例二：

• 发表日期：2022年2月23日

• 发表期刊：Microbiol Spectr（IF：9.043）

• 研究技术：ChIP-seq、RNA-seq、EMSA等

• 研究背景：

铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医院内感染的主要病原菌之一。患代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。该细菌具有多种蛋白质分泌系统，有助于其发病机制和在宿主环境中的竞争优势。III型分泌系统(T3SS)是一个关键的毒力决定因素，作者此前的研究表明铜绿假单胞菌通过cAMP/Vfr通过控制T3SS的表达；而VI型分泌系统(T6SS)是铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)的一种蛋白质分泌机制，它将效应蛋白传递到邻近的真核或原核细胞中，对细菌和宿主均起作用。作者在研究中发现nrtR突变导致Hcp分泌岛类型VI系统（H1-T6SS）的上调,研究想弄清楚其中的调控机制。

• 研究路线：

客户研究案例三：

• 发表日期：2022年1月13日

• 发表期刊：Cell Death Differ（IF：15.828）

• 研究技术：ChIP-seq、RNA-seq、EMSA、荧光素酶报告实验等

• 研究背景：

Y-box结合蛋白1 (YB-1)是一种在多种癌症（包括基底样乳腺癌BLBC）中高度表达的知名致癌基因。除了作为转录因子的作用，它被新定义为涉及RNA 5-甲基胞嘧啶的表观调节子。然而，它的具体靶点和促癌功能尚不明确。乳腺癌中KLF5的高水平表达与患者低生存率有关，但其在乳腺癌中特异高表达的机制尚不清楚。

• 研究路线：